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熒光-PCR法試驗的成功離不開優(yōu)良的試劑

更新時間:2021-05-12點擊次數:874
   熒光-PCR法是利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程,后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。PCR反應過程中產生的DNA拷貝數是呈指數方式增加的,隨著反應循環(huán)數的增加,最終PCR反應不再以指數方式生成模板,從而進入平臺期。將已知濃度的標準品梯度稀釋進行PCR,按照起始DNA量由多到少的順序等間隔得到一系列擴增曲線。Ct值與起始模板數的對數值之間存在線性關系,可以制作標準曲線。未知濃度的樣品也得到Ct值,代入標準曲線,就可以求出未知樣品的起始模板量。
  熒光-PCR法實驗成功的因素離不開優(yōu)良試劑的選擇:
  1.標準曲線的質量直接影響定量的準確性。建議使用標準品專用稀釋Buffer稀釋標準品。
  2.根據采用的熒光檢測方法進行試劑選擇。選擇探針法專用試劑。
  3.RT-PCR要根據實驗目的進行試劑選擇。mRNA表達量分析選擇兩步RT-PCR試劑,病毒病原菌檢測選擇一步RT-PCR試劑。
  4.PCR反應通常樣品數量較多,操作步驟過多易產生錯誤。選擇PCR反應用Buffer、DNA聚合酶、dNTP等試劑已經預混在一起的試劑,操作更加簡單方便。同時,使用的試劑最好不需要進行Mg2+濃度的優(yōu)化等實驗。
  5.PCR反應對反應特異性要求高。最好選擇應用DNA聚合酶的試劑。但有一點需要強調,DNA聚合酶有兩種類型,即化學修飾型和抗體結合型。使用這兩種DNA聚合酶的PCR反應條件不同,使用化學修飾型DNA聚合酶,需要在PCR條件的起初步驟設置10-15分鐘的熱變性程序,以恢復DNA聚合酶的活性;而抗體結合型DNA聚合酶,不需長時間的熱變性步驟,通常的PCR條件即可恢復DNA聚合酶的活性,適合快速PCR反應。
  6.所選試劑要與使用的RT-PCR檢測系統(tǒng)相匹配。最好選擇對各種機型裝置都顯示良好反應性能的試劑。

TEL:021-61210612

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