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PCR擴(kuò)增試劑盒在實(shí)驗(yàn)時(shí)的幾點(diǎn)事項(xiàng)解析

更新時(shí)間:2021-07-08點(diǎn)擊次數(shù):1207
   PCR擴(kuò)增試劑盒提供DNA高保真擴(kuò)增所需要的基本試劑。DNA擴(kuò)增時(shí),用戶需要自行準(zhǔn)備模板和擴(kuò)增所需要的引物。高溫嗜熱Pfu DNA聚合酶主要用于對(duì)保真度要求非常高的DNA擴(kuò)增,這些擴(kuò)增要求擴(kuò)增的產(chǎn)物中不能出現(xiàn)突變等錯(cuò)誤。Taq DNA聚合酶的擴(kuò)增性能很強(qiáng),但是用Taq擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物中有難以避免的隨機(jī)突變。Pfu DNA聚合酶除了5′-3′的聚合特性外,還有3′-5′端外切酶活性,具有校正DNA擴(kuò)增過(guò)程中突變。Pfu DNA的長(zhǎng)片段擴(kuò)增的能力不及Taq DNA聚合酶,用戶如果用于長(zhǎng)鏈PCR擴(kuò)增,可選用Long Taq或者Taq Plus DNA聚合酶。
  PCR擴(kuò)增試劑盒的實(shí)驗(yàn)事項(xiàng)說(shuō)明:
  1.樣本上多重PCR平臺(tái)可以做的樣本包括血液、唾液、口腔拭子,在實(shí)驗(yàn)中,對(duì)于DNA投入量要求不是很高,根據(jù)不同項(xiàng)目需求,DNA投入量的范圍在100 pg-100 ng之間。
  2.進(jìn)行PCR反應(yīng)前可將所有g(shù)DNA的濃度稀釋到同一濃度,并轉(zhuǎn)移到PCR八聯(lián)管中,一方面是便于排槍操作,另一方面是加入相同起始量的gDNA,這樣可降低最終文庫(kù)的濃度差異,便于混合文庫(kù)。
  3.大多數(shù)情況下引物是一管,操作相當(dāng)方便;當(dāng)目標(biāo)區(qū)域是外顯子或者是其他連續(xù)區(qū)域時(shí),我們會(huì)把引物分裝為二管,分別命名Primer pool T1與Primer pool T2,這時(shí)需要第二輪PCR前把產(chǎn)物合并,再進(jìn)行下一步反應(yīng)。
  4.執(zhí)行多重PCR反應(yīng)時(shí),特別是樣本量多的情況下,可以將T1設(shè)為一組,T2設(shè)為一組,便于制備反應(yīng)試劑混合液和排槍操作;并把解凍好的試劑放置在冰盒上,在冰盒上進(jìn)行加樣操作。
  5.實(shí)驗(yàn)中可在PCR管壁上和管蓋上同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)編號(hào)標(biāo)記,防止高溫或其他原因?qū)е掠浱?hào)消失,避免后續(xù)產(chǎn)物混合操作失誤,造成樣本交叉污染。
  6.第二輪PCR后,因?yàn)锽試劑比較粘稠,在清洗純化的時(shí)候不能吸走所有試劑,可以剩余5-10μl,否則會(huì)把磁珠一起吸走,造成樣品的損失,導(dǎo)致產(chǎn)物回收率下降。
  實(shí)驗(yàn)完成后,正常文庫(kù)濃度處于5-30 ng/μl,而片段長(zhǎng)度一般在280-460 bp之間,且主峰前后無(wú)雜峰,就可以進(jìn)行測(cè)序了。

TEL:021-61210612

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